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    结直肠癌MMP-7的表达及对微血管生成和肿瘤转移的例影响

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    内容提示: 华中科技大学硕士学位论文结直肠癌MMP-7的表达及对微血管生成和肿瘤转移的影响姓名:刘琪申请学位级别:硕士专业:胃肠外科指导教师:黄文广20040501 半尹群鞋土擎丹革菩擎础厨士学崔爵立M M PM M P一7M VDR,r_PCRcD N A英文缩略词表良acti nTIM Panti senseol i gonucl eoti deECMPU M P一1U m puPAm atri xm eta】】oprotei nases基质金属蛋白酶m atri l ysi n基质溶解因子m atri xm etal l oprotei nases微血管密度reversetranscri ptase—Pol ym erasechai nreacti on反转录聚合酶链反应Com pl em entary deoxynbonucl eJ caci d互补脱氧核糖核酸口一肌动...

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    华中科技大学硕士学位论文结直肠癌MMP-7的表达及对微血管生成和肿瘤转移的影响姓名:刘琪申请学位级别:硕士专业:胃肠外科指导教师:黄文广20040501 半尹群鞋土擎丹革菩擎础厨士学崔爵立M M PM M P一7M VDR,r_PCRcD N A英文缩略词表良acti nTIM Panti senseol i gonucl eoti deECMPU M P一1U m puPAm atri xm eta】】oprotei nases基质金属蛋白酶m atri l ysi n基质溶解因子m atri xm etal l oprotei nases微血管密度reversetranscri ptase—Pol ym erasechai nreacti on反转录聚合酶链反应Com pl em entary deoxynbonucl eJ caci d互补脱氧核糖核酸口一肌动蛋白组织基质金属蛋白酶抑制反义寡核苷酸extracel l ul ar m atri x细胞外基质即putati ve m etal l oprotei nase有争议的金属蛋白酶~l 即M M P一7uteri ne—m atri x m etal l oDrotei nases子宫金属蛋白酶即M M P一7uroki nasepl asm i nogenacti vator尿激酶型血浆素原激活剂Tum or necrosi s factor 半尹群雀土学珂苹压葶础研士轳往莽jM T- M M PTPAEG FTG F—BPD G FConAD M FOEntacti nAPM AG ATA.1C/EBPN F—IL6肿瘤坏死因子膜型基质金属蛋白酶乙酸豆寇佛波酯epi derm al grow thfactor上皮生长因子transform i ng grow thfactor-B转化生长因子Bpl atel etderi vedgrow thfactor血小板衍生生长因子Concanaval i nA刀豆凝集素Adi fl uom m ethyl om i thi ne,二氟甲基鸟氨酸巢蛋白am i nophenyIm ercuri c—acetate乙酰氨基苯汞红细胞转录因子一1人肺癌细胞转录因子白介素6核转录因子2 孚尹群攫父学丹莘正擎砖坷壬学往莽主结直肠癌M M P.7的表达及对微血管生成和肿瘤转移的影响研究生:刘琪导师:黄丈广教授华中科技大学同济医学院附属协和医院胃肠外科中文摘要目的大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,发病率仅次于肺癌,胃癌,肝癌。随着饮食结构和生活环境的变化,我国大肠癌发病率从六十年代的十万分之六,猛增到九十年代的十万分之二十四。随着现代科学技术的进步,不断有新的诊断和治疗手段出现,但是,大肠癌的预后仍不容乐观,仍有较高复发率。随着对肿瘤基因水平的深入研究,发现侵袭和转移与肿瘤微血管及细胞外基质降解密切相关。其中基质金属蛋白酶是目前研究肿瘤侵袭和转移的热点。本文主要探讨了结直肠癌中M M P.7在蛋白质水平和基因水平的表达,并在蛋白质水平上对M M P.7对微血管生成进行了一些研究。方法1.应用免疫组织化学s—P法,检测56例结直肠癌组织及8例正常组织M M P一7的表达和微血管密度及其与临床病理参数的关系。 半尹井碰土学眄萍正乒砣珂士尹雀番j t2.采用手术切除的20例大肠癌肿瘤组织,以距肿瘤10cm 以上的正常粘膜作为对照,通过RT-PCR法,以B—acti n为内对照,对扩增以后的结直肠癌组织和癌旁组织M M P一7基因表达产物通过凝胶成像系统得出电泳泳带图像,应用图像分析软件进行分析。结果1免疫组化:( 1) 在56例结直肠癌组织中M M P.7的阳性表达率为73%,M VD值为36.41士5.76与对照组差异具显著性(P<O .01,P<0 01,)(2)高中分化和低分化的结肠癌组织M M P一7表达无差异( P>0 05) ,其M VD值有差异( P<0.05) 。D ucks分期eP( A+B) 、( C+D ) 期的M M P-7表达及M VD值有差异( P<O .05,P<0.01,) ,淋巴结转移组和无转移组的M M P一7表达及M VD值均有显著差异( P<O .叭,见表2) 。2.20例结直肠癌组织中有19例扩增出M M P一7cDN A,在正常粘膜中无一例阳性表达。两者差异极具显著性。( 2) 结直肠癌组织中M M P一7的阳性表达同Dukes密切相关,Ducks分期中( A+B) 、( C+D) 期的M M P一7基因表达有显著性差异。结论M M P-7的表达和微血管生成与结直肠癌侵袭转移及分期密切相关,M M P一7与结直肠癌血管生成密切相关,联合检i ⅢJ J M MP.7和M VD对结肠癌的治疗、预后判定有~定的价值。关键词结直肠癌基质金属蛋白酶一7血管生成微血管密度转移免疫组化逆转录聚合酶链反应4 半尹群擞父争眄蒂蘑擎础并士学崔芥主Expressi onof M M P一7 i n Col orectal Carci nom aand i ts effect onM VD( m i crovessel densi ty)and M etastasi sG raduate:Li uqiTut or:H uangw enguangD epartm entof G eneral Surgery, Xi eH e Hospi tal ,Tongj iM edi calCol l ege,H uazhong U ni versi tyof Sci ence andTechnol ogyAbstractO bj ectsCol orectalCarci nom a i s one of the m ostcorrf f nol l m al i gnanttum ori n ourcountry, w i ththe i nci dence rate i s secondonl y pul m onary carci nom a,gastri ccarci nom a,H epatocarci nom a.W i ththechangesof di et andl i vi ng envi ronm ent,the i nci dence rate of col orectal Carci nom a i ncreased from0.06‰i n 80’ Iastcenturyto O .24%oi n 90’ l astcentury.W i ththedevel opm entsof m odemsci enceandtechnol ogy, thereare m ore and m ore newdi agnosti c andtherapeuti cm odal i ti es.But theprognosi sof Col oreetal Carci nom a i s rem ai nspoor, andtherecurrence rate i s ratherhi 曲.Recentl yi t has beenreportedthat the tum orti nyvascul ar creati on anddegradati onof the extracel l ul ar m atri x w ere i nvol ved i n5 半尹一点^垆珂牛正擎虎研士争往蚤主the i nvasi on and m etastasi s.M atri x m etal l oprotei nase( M M Ps) w ere presenthotspotofgenel evel research of tum or i nvasi on and m etastasi s.W e researchedtheexpressi onof M M P一7 ofgeneandprotei nl evel i n thi spaper, anddi scussedThe effect of theexpressi onsof M M P一7 onM VD( m i crovessel densi ty) andm etastasi s i n col orectal carci nom a.M ethods1.Im m unohi stochem i cal m ethod w as used to detect M VDand theexpressi onof M M P- 7 i n 56 col orectal carci nom a and 8 norm al col orectal ti ssue.2.Tw entycases of rectal carci nom a tum or ti ssues w hi ch w ere rem ovedbyoperati oncontrastw i tIlnorm alm ucosa w hose di stance w as above 10centi m eter from tum or.B—acti n as the i nternal standardsystem ,carryi ngout reversetranscri pt-pol ym erasechai nreacti on( RT-PCR) technol ogy,el ectrophoresi sbel ti m agesw ere attai nedby am pl i fi ed productsi ngel atumi m agi ng systemandanal yzed by i m ages anal yzi ngsoftw are.Resul ts1.Im m unohi stochem i cal m ethod:There w eresi gni fi cant di fferent betw eencol orectal carci nom a ti ssue and norm alcol orectal ti ssue i nexpressi onofM M P一7 andM VD(73%,36.414-5.763VS O %,21 35士3.391,P<0 01) .Theoverexpressi onof M M P一7 w as correl ated tol ym phnode m etastasi s andD ucks gradeofcarci nom a( P<0.05) .M VD of col orectalcarci nom a W B.Ssi gni fi cantl ycorrel ati on w i th di fferenti ati on、Ducks grade of carci nom aandl ym phnodem etastasi s,(P<0.01).The m ean M VD i ngroupw i thM M P_7posi ti ve w assi gni fi cantl y hi gherthan that M M P一7negati verP<O .01).6 半尹群或文学眄萍《妒虎珂士擎往替j t2.RT.PCR:the 19 cases( 95%) of 20 cases col orectal carci nom a am pl i fi edM M P一7cD N Anam el y M M P- 7expressi on Posi ti ve,none( O %) am ongnorm al m ucosaexpress posi ti ve,therew as extrem e stati sti cal di fference.Theposi ti ve expressi onM M P- 7 i n the cancer ti ssue correl atescl osel yw i thcl i ni calcol orectalcarci nom aD ukesstage.therew assi gni fi cantl ydi fference betw eenDucks( A+B) and Dukes( C+D) .Conel usi onThe overexpressi onof M M P· 7 and i ntratum or M VD arestrongl yrel ated tO thei nvasi on and m etastasi s of col orectalcarci nom a andthey m aybe val uabl ei ndi ctor forassessi ng prognosi sand forsel ecti ngsui tabl etherapyforpati ents.Keyw ordsCol orectal carci nom aM atri xm etal l oprotei nase一7Angi ogenesi sM VDM etastasi sIm m unohi stochem i stryRT- PCR7 半尹群擞土炉眄蒂.f笋虎坷士萨往井t月lJ舌大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,在我国的发浦率有增高的趋势,仅次于肺癌,胃癌,肝癌。随着饮食结构和生活环境的变化,我国大肠癌发病率从六十年代的十万分之六,猛增到九十年代的十万分之二十四[” 。大肠癌恶性程度高,早期即可通过淋巴、血运发生微转移,虽可通过手术、放化疗予以治疗,随着现代科学技术的进步,不断有新的诊断和治疗手段出现,但是,原发性大肠癌的预后仍不容乐观,仍有较高复发率。因此有必要研究与大肠癌生长、侵袭和转移有关的因索,寻找更有效的诊断及预测侵袭、转移,以指导治疗的生物学指标。研究发现,肿瘤侵袭、转移是恶性肿瘤的特有行为,也是目前治疗难有较大发展的重要原因m 【3J 。通过研究肿瘤侵袭、转移相关基因的改变,可使我们深入了解肿瘤侵袭、转移的分子机理,为临床肿瘤分期、治疗及预后的评价提供理论依据。随着对肿瘤基因水平的深入研究,发现侵袭和转移与肿瘤微血管及细胞外基质降解密切相关【4】。大肠癌的侵袭与转移是~个复杂的多因素相互作用的结果。近年来的研究提示:癌细胞与细胞外基质之间的相互作用是肿瘤发生侵袭和转移的一个重要环节【5】。肿瘤细胞首先作用于基底膜,促使其降解,基底膜是肿瘤缅胞与深层基质之间的一道屏障,肿瘤细胞~旦突破基底膜即在基质内较快侵袭性生长并发尘转移【6】’ 【” 。而在肿瘤细胞从原位增殖到侵袭转移过程中,必须借助于能作用于细胞外基底膜和基质的酶,并在相关因子的协同作用下,完成这种侵袭的过程【810其中,基质金属蛋白酶是最重要的一类酶类。检测基质金属蛋白酶的方法很多,如:免疫组化法、酶联免疫吸附法、 华尹祥碰土擎用莘正学砧研士擎红替主m RN A提纯和分析、N orthem 印迹杂交技术和RT-PCR法等m [ i ol 。常用的有免疫组化法,是从蛋白表达水平进行检测分析。而RT-PCR法是新近迅速发展起来的RN A诊断技术,其原理是从某一特定基因有表达的组织中提取总的RN A.经逆转录反应生成cDN A,然后,在特异于该基因的外显子引物对的指引下进行PCR,扩增的eD N A片段经凝胶电泳分离后,经光电密度扫描仪计算出相应的m RN A含量,具有准确、敏感、简便的特点⋯ J {I-' 1。本课题选用免疫组化和RT-PCR的方法分别从蛋白质水平和基因水平分析M M P.7在大肠癌中的表达及其同微血管密度的关系,以及其同病理分期的关系。 葶尹井盛土笋眄莘正学砧碍士擎往替J 亡实验材料和方法第一部分免疫组化S-P免疫组化染色试剂盒采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。即用型试剂盒,省时,省力,广谱即用型试剂盒可以大大避免由抗体和检测试剂盒配对不符引起的假阴性反应㈣,【14】,f15】。1、材料与方法11临床资料收集我院自2003.01~2003—08间的手术切除的结肠癌标本56所有患者术前均未接受化疗、放疗或其它针对肿瘤的治疗。男37例,女19例,年龄30~73岁。其中直肠癌38例,右侧结肠癌5例,左侧结肠癌13例,Dukes分期A期7例,B期15例,C期28例,D期6例。有淋巴结转移者36例,无淋巴结转移者20例。选取8例癌组织周边10cm 处结直肠组织做对照。所有标本均用10%甲醛溶液固定。1.2试剂抗M M P-7单克隆抗体,兔抗人FVl l I因子单克隆抗体及SP试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。1.3试剂盒:sP试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司1.4显色剂:DAB购自福州迈新生物技术有限公司1.5其它试剂:二甲苯为汕头市光华化学厂产品,无水乙醇为广东达壕精细化学公司产品,磷酸二氢钠、磷酸氢二钠为北京化学试剂公司产品,氯化钠为上海化学试剂有限公司产品,柠檬酸抗原修复缓冲液、EDTA抗原修复缓冲液、免疫组化笔及部分防脱玻片为福州迈新生物技术有限公司产品。0 半尹群盛克擎, 4/苹正擎础坷士|笋拉静上1.6主要仪器:日本奥林巴斯双目显微镜、德国DM R4-Q 550Lei ca病理图像分析仪、德国Lei caM PS60全自动照相系统、Lei ca切片机。2.实验步骤与结果判断标本为10%福尔马林固定,石蜡包埋之存档蜡块,每个蜡块连续切片3张( 厚度为3urn) ,留一张备用。所有切片均在58。C烤箱烘烤3—4小时以防脱片,留住备用。2.1免疫组化实验步骤( SP法) :21.1.切片58℃烤箱烘烤10分钟,然后常规用二甲苯脱蜡、梯度酒精水化。2.1.2蒸馏水漂洗3次x 3分钟,接着PBS漂洗3次x 3分钟。2.1.3抗原修复:根据一抗要求,M M P一7用EDTA抗原修复液高温高压修复1分钟,CD34用柠檬酸抗原修复液高温高压修复1分钟。2.1.4冷却至室温,PBS浸泡,免疫组化笔画圈,减少试剂扩散和浪费。2。1.5每例切片滴加试剂A( 过氧化物酶阻断溶液) 室温下孵育15分钟,抑制内源性过氧化物酶,PBS漂洗3次X 3分钟。2.1.6每例切片滴加试剂非免疫性动物血清( 试剂B) 室温下封闭10分钟。2.1.7每例切片滴加相应的单抗,阴性对照片以PBS液代替一抗,用正常组织作正常对照,湿盒内4。C过夜;次日复温后,PBS漂洗3次x 5分钟。2.1.8每例切片滴加试剂C( 生物素标记的第二抗体) 室温下孵育l O 分钟,PBS漂洗3次x 3分钟。2.1.9甩去PBS液,,每例切片滴加试剂D( 链霉素抗生物素蛋白一 半尹拜收土擎眄苹叠学砧研壬学往尊立过氧化物酶溶液) 室温下孵育10分钟,PBS漂洗3次x3分钟。2.1.10每张切片加2滴或100ul 新鲜配制的DAB( 或即用型DAB工作液) ,显微镜下观察3~10分钟。2.1 11自来水充分水洗,蒸馏水洗5~10秒钟。2.1.12用淡苏木素复染细胞核,半分钟左右。自来水洗5~10分钟。2.1.1380%、90%,无水酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封弱。2.2阴性对照:选取8例大肠癌肿瘤组织,按2.1的操作步骤进行时不加一抗,而以PBS液取代,结果均为阴性染色。3结果判断:M M P.7判定标准:阳性反应部位呈棕黄色,细胞核呈淡蓝色。随机观察高倍镜( 40× 10) 下6个视野,依着色细胞的百分比分成2组,(一)O %~10%肿瘤细胞阳性,(+)>10%肿瘤细胞阳性,结果用百分率表示㈣,㈣。M VD判断标准:先在低倍镜(× 40)下找出结肠癌组织中微血管最密集的部位,然后在高倍镜(× 200)T进行观裂M 】,[17]。计算参照W ei dner等的评判标准,计算结肠癌内着色的毛细血管和微小血管,凡呈现棕色单个内皮细胞、内皮细胞群无管腔且与邻近的微血管或其它结缔组织成分有明显区别的均作为一个血管计数,但肌层较厚及管腔面积大于8个红细胞直径的血管不计数‘ 18l 。计数方法,每张染色切片选择5个血管最多的癌间质区,在200倍视野下进行血管计数,每例标本计数5个视野,取其平均值‘ 伸】。4统计学方法采用SPSSl 0.0软件包进行统计学分析,计数资料用x 2检验,计量资料用t检验。 半尹井戏^学眄薛岳学础珂壬争拉蚤t第二部分RT- PCR实验材料及方法实验仪器和材料1.主要仪器设备:PCR仪( G eneAm pPCRsystem9600) :PE公司。凝胶成像分析系统.( G D S8000犁)高速台式低温离心机Beckm an公司。TH I一82恒温摇床上海跃进医疗器械厂。一84"0超低温冰柜日本三洋公司M DF一382普通冰箱青岛海尔公司BCD.268紫外分光光度计日本岛滓公司电泳仪北京六一仪器液氮罐2.实验用试剂Tri zol 试剂G i bco公司D EPC水BIB公司琼脂糖Prom ega公司溴化乙锭si gm a公司普通Taq酶、逆转录酶G i bco公司O l i go—dTG i bco公司dN TP、D N AM arkerProm ega公司M M P-7引物及内参照基因B—acti n引物分别参照文献㈣㈣设计;由上海生工生物工程公司合成。3.临床资料:采用手术切除的20例大肠癌肿瘤组织,其中Dukes A期3 孚产群碰上笋舟带《母砧研士擎往蔷j t例,B期6例,C期7例,D期4例。以距肿瘤l O cm 以上的J 下常粘膜作为对照。实验方法:1.提取总RN A( 1) 将约100m g冰冻组织置于研钵中,用研棒低温下快速研磨( 5分钟内完成)。( 2) 将组织碎片移入一EP管内。( 31[ m l TRIzol ,吸管反复吹打几次,溶解细飑。( 4) 放室温静置15分钟。12,000rpm 离心5m i n,弃沉淀。( 5) DN A.O .2m l 氯仿( O .2m l /m 1) ,反复振荡摇匀。( 6) 室温静置10分钟。( 7、12000r/m i n,4℃离心l O 分钟。( 8) 小心吸取上层水相置于另一新的无菌Eppendorf管中。( 9) 于管中加入o.5m l 异丙醇,混匀,于4V沉淀1小时。( 10) 12000r/m i n,4℃离心10分钟,弃上清,沉淀用75%酒精洗两遍。(1 1) 5000r/m i n,4℃离心5分钟。( 12) 弃上清,让沉淀在室温下自然干燥。( 13) 每管用10u 1无RN Aase的纯水重悬干燥后的RN A,置于冰浴立即用于cDN A合成或置一80℃冰箱长期保存。RN A定量:取4 uIRN A加无菌去离子水适当倍数用紫外分光光度计分别测定O D260,O D280数值,以估算RN A纯度。纯RN A样品O D26dO D280在1.8~2.0,低于此值表明存在蛋白质污染,可重新抽提[20】。2.逆转录反应:( 1)RN A样品在75。C变性5分钟,将离心管迅速插入到冰中冷却。( 2)依次往离心管中加入以下试剂:4 学尹拜碰上学丹萨正擎础珂士擎往蚤j 亡总RN A2 u lD EPC水5 u 15× buf f er4u 1dN TP4 u lO l i go(dT、1 u lRN ase抑制剂2 u1AM V逆转录酶2 ul( 3) 42℃水浴1小时。( 4)将反应管在95℃加热5分钟,然后快速冷却至4。C,以灭活逆转录酶,并防止逆转录酶与eDN A结合。3.PCR:( 1) 依次往离心管中加入以下试剂5 孚尹群建土笋丹萍正乒础珂士荦错巷土无菌重蒸水10× buf f erdN TPM gCl 2;1物TaqD N A聚合酶cD N A14.5 u 12.5 ul2u l2 U I2 u ll u 11 u 1总反应体系25 u1( 2) 加入100u l 液体石蜡,使之覆盖在反应液上,防止液体蒸发( 3) 短暂离心后,将反应管置PCR仪中,按TYU 程序作热循环:410¨ 1PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后,紫外灯下观察电泳带及其位置,并与标准核酸分子量比较被扩增产物的大小。于凝胶成像分析系统( G DS8000型) 中进行条带密度扫描分析,用M M P一7与目.acti n条带密度比值表示M M P一7 m RN A表达水平。统计学方法采用SPSSl 0.0软件包进行统计学分析,计数资料用x 2检验计量资料用t检验。 半产井文土擎眄莘正擎砣爵士学拉普j 芒结果免疫组化1.M M P-7在结直肠癌和正常结直肠组织中的表达M M P一7在癌组织中主要着色于癌细胞的胞浆,阳性细胞在癌巢中的分布是不均匀的,常位于癌巢周边。除了少量单核细胞,间质细胞无阳性染色。靠近肿瘤的正常组织亦无染色,这表明M M P.7的表达仅限于肿瘤细胞[22】,[23】,【24】。正常大肠组织M M P.7无表达,而大肠癌组织的阳性表达率为73%( 41t56) ,两者差异有显著性( P<O .01) ,具有统计学意义。结直肠癌M VD值明显高于正常组织(P<O .01,见表1),有显著的差异。2.M M P-7与结直肠癌一般病理特征男、女性结直肠癌组织中M M P-7表达和M VD均无差异( P>O .05) ;结肠癌和直肠癌的M M P一7表达和M VD均无差异f P>O .05)。M M P.7与临床病理特征高中分化和低分化的结肠癌组织M M P一7表达无差异( P>O .05,见表2) ,其M VD值有差异( P<O .05,见表2) 。Ducks分期中( A+B) 、( C+D) 期的M M P一7表达及M VD值有差异( P分N <0.05和O .01,见表2) ,淋巴结转移组和无转移组的M M P一7表达及M VD值均有显著差异(P<O .0l ,见表2)。3.M M P- 7与M VD 的关系56例结肠癌组织中M M P.7阳性组M VD 值比阴性组M VD 值高( P<O .01,见表3)。 半尹群擞上学眄革压尹础研士擎往巷主吲I二PCR1.组织总RN A质量的鉴定本实验采用Tri zol 法提取组织总RN A,经紫外分光光度仪测定RN A样本的纯度值( O D260/O D280) 在1.87左右( 1 8031.952) ,表明RN A纯度足够,可进行RT-PCR扩增分析。2.M M P-7基因在结直肠癌组织和正常结直肠癌组织中的不同表达。比较20对结直肠癌组织和和正常结直肠癌组织中的表达,PCR扩增产物的电泳。结果表4,在95%结直肠癌组织( 19/20) @ M M P.7m RN A表达呈阳性,而在正常结直肠组织中无一例阳性。通过SPSS统计软件分析,采用卡方检验进行两组标本M M P一7m RN A表达量高低比较,结果显示两者具有极显著性差异( P<O .01,见表4) 。3。M M P-7基因与结直肠癌Dukes分期的关系通过SPSS统计软件分析,采用T检验比较大肠癌D ukes( A+B) 和Dukes<C+13) 表量高低比较,结果显示两者具有显著性差异( P<0.01,见表51。 半尹一盛土擎一萍重争砣坷士擎往*j t表1正常结宣肠组织和癌组织中的M M P.7表达及M VD竺j 鲎兰二芝三癌组织56正常组织8兰竺417336.4V-5 760021.35± 6 39性别男女3719肿瘤部位结肠直肠3818肿瘤大小( cm )≤5>52333分化程度高、中低3224淋巴结转移261529121922221970.378.976.366.782 666.768.879.137.04± 6.4236.17± 5 8937.10± 6;4535.77± 4 4138.01± 4.5735.97± 4 4532.83± 5 14-39.74± 6 18(一)( +)203694531 4515.5438.79± 4.473288.9D ucks分期A+B22122954.530.85± 3 18C+D3485.339.45-4-5.12耋i 坚坚里:! 皇坚∑里塑苤丕类M M P.7MVD( ;± s)39-47士4· 7631.75+5,399 兰! ! 苎苎! ! 苎! ! 苎! 兰苎竺兰苎表4M M ] P.7m RN A在结直肠癌和正常结直肠组织中的表达类型馓—丽笋巡警表5M M P.7m RN A与结直肠癌Dukes分期关系D ucks分划恻数M M P.7m RN Af;±A+B90.38± 0.13C+Dl l069± 0.19一常大肠组织中rom p--7染色阴。盹100x『F常大肠组织中m m p--7阴悱400x大肠痛组织m m p--7阴悱:对照100x大肠癌组织m m p--7阴‘ n对照400x20 争产一直土拳厚#重擎磨■ 士爹租碡冀大肠癌组纵rom p--7染也阳性染成棕黄色的为阳rJ :表达100XIF常组织M VD可见染成棕黄色『『J 微血管200X大肠癌组织m m p--7染色阳‘ PI:400X大肠痛组纵M VD微血管数量远较币常组织为200X矿常大肠纽织与肿瘤组织rom p--7 m RN A表达比较T为肿瘤组织N 为『F常组织2 41尹群盛土学柙薛正笋虎坷士擎拉再立讨论大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,在我国的发病率有增高的趋势,仅次于肺癌,胃癌,肝癌。大肠癌恶性程度高,原发性大肠癌的预后不容乐观,仍有较高复发率。因此探讨结直肠癌的发生发展机制,并进一步探索防治方法,是有效治疗结直肠癌的希望所在。研究发现,肿瘤侵袭、转移是恶性肿瘤的特有行为,也是目前治疗难有较大发展的重要原因。随着对肿瘤基因水平的深入研究,发现侵袭和转移与肿瘤微血管及细胞外基质降解密切相关。大肠癌的侵袭与转移是一个复杂的多因素相互作用的结果。近年来的研究提示:癌细胞与细胞外基质之间的相互作用是肿瘤发生侵袭和转移的一个重要环节。而在肿瘤细胞从原位增殖到侵袭转移过程中,必须借助于能作用于细胞外基底膜和基质的酶,并在相关因子的协同作用下,完成这种侵袭的过程。其中,基质金属蛋白酶是最重要的一类酶类。检测基质金属蛋白酶的方法很多,如:免疫组化法、酶联免疫吸附法、m RN A提纯和分析、N orthem 印迹杂交技术和RT-PCR法等。常用的有免疫组化法,是从蛋白表达水平进行检测分析。而RT-PCR法是新近迅速发展起来的RN A诊断技术,其原理是从某一特定基因有表达的组织中提取总的RN A,经逆转录反应生成eDN A,然后,在特异于该基因的外显子引物对的指引下进行PCR,扩增的eDN A片段经凝胶电泳分离后,经光电密度扫描仪计算出相应的m RN A含量,具有准确、敏感、简便的特点。本课题选用免疫组化和RT-PCR的方法分别从蛋白质水平和基因水平分析M M P一7在大肠癌中的表达及其同微血管密度的关系,以及其同病理分期的关系。M M Ps是高度保守的依赖于锌离子的内切蛋白水解酶家族,可降解基底 半尹祥碰上学眄带正笋砣珂士擎社替t膜和细胞外基质的大多数蛋白质【2“ 。目前已知至少有26种M M Ps,可分为可溶性M M P及膜型M M P两大类【2” 。可溶性M M P可进一步分为胶原酶,基质降解酶,白明胶酶,基质溶解因子和和其它具有底物特异性的酶。大多数可溶性M M P是以具有前蛋白区的非活化的酶原形式从细胞分泌的[ 28】[291。各种M M P家族成员的分子结构中一般都保留了三个特征区域【2⋯。第一个区域为前肽序列,协助M M P分子的分泌后迅速水解掉,在成熟的M M P分子中并不存在。第二个区域( 催化区域) 包含有组氨酸残基形成的锌结合区域,它是酶的催化活性区域。第三个区域包含一个与血红素结合蛋白同源的序列,与底物的特异性有关‘ 291· [30】· ㈨。然而,M M P.7只具有前二个区域,而缺乏c末端的血红素结合蛋白同源区域㈣,[33】。而M M P分子结构中C末端区域为基质金属蛋白酶组织抑制剂( TIM P) 与M M P相互作用的区域,调节着TIM P的活性[32】,[331。因此M M P一7具有强大的基质降解活性和广泛的底物特异性,同时受TIM P的负调节较小【” 】。这也是M M P.7在大肠癌中的作用比其它M M P家族成员显得更为重要的分子基础。Baragi 比较了M M P.7,缺乏c末端的血红素结合蛋白同源区域的基质降解酶及全长的基质降解酶的结合TIM P—l 的能力。发现这些分子都可以和TIM P.1相结合,而抵抗凝胶过滤的分离。当同全长的基质降解酶竞争时,M M P一7和缩短的基质降解酶同TIM P一1的结合力减弱【34] 。这些资料说明M M P一7缺乏的碳末端域有助于同增加M M P同生理性抑制剂的亲和。说明M M P.7比其它M M Ps更难以抑制。在有关体外实验的报道中,M M P.7表达高的结直肠癌细胞在琼脂糖培养基上呈蟹爪样生长,而表达低的细胞呈团块样生长.说明M M P.7的高表达是癌细胞侵袭能力增强的一个重要因素【35】,[36]。M M P一7基因定位于1l q21一q22,其DN A长1.6 kb,编码267个氨基酸。在正常组织中,M M P一7表达于子宫内膜的分泌性和导管上皮细胞中,同时也可表达于各种外分泌腺。其分解底物主要有纤维连接蛋白、IV胶原、层 {I尹群矗上学眄苹《擎础珂士擎往蔷主连蛋白和钙粘素等。M M P.7除参与胚胎发育、创伤修复、和器官形态发生等组织再生过程,而且可通过降解细胞外基质和促进毛细血管的增生在肿瘤的浸润和转移等演进过程中重要作用【36l 。M M P一7在各种癌组织中呈过度表达,其中包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、肺癌等。各种M M P在癌组织中表达时都位于基质细胞中,而不在肿瘤细胞中。然而M M P一7却表达于肿瘤细胞中,在基质细胞中并不表达【321。本课题中免疫组化实验表明:正常大肠组织M M P.7无表达,而大肠癌组织的阳性表达率为73%,两者差异有显著性( P<0.01) ,具有统计学意义。RT—PCR实验中,95%( 19/20) 的结直肠组织表达阳性,而在正常组织中亦无一例表达。这与国内外报道相一致。这说明大肠癌细胞获得恶性表型的同时具备了降解基底膜和向周围组织浸润、转移能力、M M P一7参与了大肠癌的发生发展过程。M M P.7阳性的癌细胞呈灶状或片状分布,且多位于癌边缘或管腔近旁,提示具有转移潜能的癌细胞多位于肿瘤结节的表面或周边,因而也符合肿瘤细胞向周边侵袭、脱落并向远处转移的假说。而免疫组化法同RT-PCR结果有较大差距,除了可能因组织取材和试剂方面的差距外,RT—PCR方法远较免疫组化法灵敏可能是其主要原因。因此,这一结果可能同时也反应了两种实验方法灵敏性上的差别。定性研究的组化实验中,Dukes( A+B) 阳性率54.5%,Ducks( C+D) 脚J 性率85.3%,差异具显著性( P<O .05) 。而在半定量R了.PCR中,Dukes( A+B) 与Ducks( C+D)的m RN A表达亦有显著性差异。由于Ducks分期可以反映肿瘤浸润和转移的程度,因此M M P一7的表达与肿瘤组织的侵袭性呈正相关,这与说明M M P一7在大肠癌的发展、浸润和转移过程中发挥了重要作用。淋巴结转移组M M P· 7表达率88.9%也显著高于无淋巴结转移组45%fP<O .oi ) ,晚明M M P一7含量高的癌细胞更易于侵入淋巴管而形成淋巴结的转移。Y Adachip7】等用免疫组织化学的方法测定T78例人大肠癌M M P一7的 葶尹样戎上学阿蒂正学础研士擎往番j 亡表达,其阳性率达46%,而在『F常组织中没有表达。其中Ducks( A+B) 阳性率32%,Ducks( C+D) 阳性率55%,两者差异具有显著性。同时,M M P.7的m RN A表达水平与大肠癌的Ducks分期有关,在发生肝转移的大肠癌中M M P一7的表达比无肝转移的大肠癌显著增高。提示M M P一7m RN A的表达水平与大肠癌的进展有关,M M P一7在大肠癌发生肝转移的过程中可能起促进作用。这些都同本实验的结果相一致。Fol km ant” 1于上世纪六十年代提出肿瘤的生长取决于血管生成,如果没有血管生成,原发肿瘤的生长不会超过1—2m m ,这一结论已为大多数学者认同,从而为肿瘤研究开辟了新的领域。实体肿瘤的生长需要血管来提供营养和排泄自身代谢产物。恶性肿瘤发展由无血管期过渡到血管期,具有诱导血管生成的能力,由于肿瘤新生血管本身结构上的缺陷,稳定性差,通透性高,为癌细胞的转移提供了条件【391。研究表明,肿瘤生长和转移在很大程度上依赖血管生成,依赖周围组织的血管支持以提供增殖和转移所需的条件。结直肠癌在其形成及转移过程中,肿瘤血管的形成为肿瘤的生长和播散提供了途径[ ” J 。近年来许多研究揭示M VD是一个显著用于判断肿瘤转移的危险程度、预后及整体生存率的因素‘ 38】。近年来研究表明,M VD在多种恶性肿瘤中升高。本研究结果显示第Ⅷ因子单克隆抗体标记血管内皮细胞,使在光学显微镜下常规染色无法辨认的微血管经免疫标记后可以识别,从而准确计数局部肿瘤组织内的微血管数。正常大肠组织的M VD值明显低于大肠癌组织,有统计学意义,且肿瘤组织中M vD值最高的位置在癌巢周边,及侵袭转移最活跃的区域,说明肿瘤组织需要较多的血管供应养分,在侵袭过程中必须有新生血管伴随。M M P一7阳性大肠癌组织的M VD值明显高于阴性组织的,有显著差异,证实MMP一7有促进血管形成的作用。在本实验中还得出,淋巴结转移组M V D 值明显高于未转移组,D ucks分期( C+D ) 期的M VD值明显高于Ducks分期( A+B) ,低分化组M VD值高于高、中分化组,均有统 毕尹拜爱上学阿萍重炉础珂士擎矗番主计学意义,说明大肠癌组织内的M VD与肿瘤细胞的分化程度、侵袭程度、淋巴转移均有一定的联系,肿瘤M VD值较高者,就会有较强的侵袭能力和转移能力。由于M M P.7同大肠癌的发生、浸润和转移密切相关。故以抑肯qM M P一7作用的各为靶点研制M M P一7抑制剂,可有效地抑制肿瘤生长、侵袭、转移和复发,成为肿瘤防治的一条新途径【39】。已有~些M M P的人工合成抑制剂受到人们的重视。抑制金属蛋白酶活性的人工合成抑制剂在国外已。进行研究,巴马司他是其中一种广谱抑制剂,在对人结直肠癌肝转移瘤和肺转移瘤的小鼠模型进行药物试验,结果肝转移瘤的数目、癌细胞的数量均减少,肺转移瘤的数量减轻。其第二代产品马马司他也己应用于临床p⋯。但是,由于M M Ps的作用范围较广,长期应用其抑制剂不可避免的带来一些副作用。另一方面,有研究表明将M M P一7的反义寡核营酸导入结肠癌细胞中可抑制其在体外的侵袭和转移,并可在裸鼠体内有效地抑制结肠癌细胞的实验性肝转移[4⋯。目前,反义寡核苷酸的应用已经成为治疗大肠癌最具潜力的途径,很多反义寡核苷酸也已进入临床试验阶段。结论综上所述,M M P.7参与了结直肠癌突破基底膜,向间质浸润和转移,M M P~7的过表达同肿瘤的进程密切相关。利用免疫组织化学及RT,PCR的方法检测大肠癌组织中M M P一7的表达,对临床上判断肿瘤转移可能性、生物学行为及其指导后期的临床治疗均有重要参考价值。参考文献1.北京军区消化专业组( 李世荣整理) .序贯法粪隐血试验在大肠癌初筛中的应用一102,800无症状人群普查结果一.中华肿瘤杂志1993;15:230.233 半尹祥碰土学用蒂重萨础珂士学稚莽主2.Bri kedal —H ansenH,M ooreW GI,BoddenM K,eta1.m atrj xm etal 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oftheprecursor,i nteracti on w i th otherm atri xm etal l oprotei nasesandenzym ati c properti es,JBi ol Chem1995;270:6691-7.37 Y Adacbi .The Rol e of M atri xM etal l oprotei nases i n Tum orAngi ogenesi sTum orm etastasi s.Pathol ogandO ncol ogyResearchVol7,N ol ,200l :14---23.38 Fol km anJ .W hat i s the evi dence that tum ors areangi ogenesi s dependent?JN atl Cancer l nst.1990 J an3;82(1):4—6.39w i tty J P,M cDonnel l S,N ew el l K.I,et a1.M odul ati onofm atri l ysi nl evel s i ncol oncarci nom a cel l l i nes aVectstum ouri geni ci tyi n vi vo.Cancer Res 199454:4805-12.40 KazukiN abeshi m a,Teruhi koInoue,Yoshi yaShi m aoandTetsuroSam eshi m aM atri xm etaU oprotei nasesi n tul nor i nvasi on:Rol e for cel lm i grati on Pathol ogy Internati onal ,2002,52:255—264, 葶产群崔土乒眄弟正擎础研士笋往替j 亡基质溶解因子的结构、功能及其在肿瘤组织中的表达基质金属蛋白酶在组织重塑过程中可降解细胞外基质( ECM ) 的成分【11。基质溶解因子( M M P一7) 是基质会属蛋白酶家族成员之一,M M P.7具有强大的基质降解活性和广泛的底物特异性,对许多细胞外基质成分,如胶原蛋白,蛋白多糖,弹性蛋白,层粘连蛋白,纤维连接蛋白及酪蛋白均有水解作用[1]【2】吼虽然基质溶解因子(M M P.7)在其底物特异性上同基质降解酶相似,而且其催化区的结构同间质胶原酶相似,但其C末端片断的缺失使其有别于其它M M P基因【2】。M M P一7在乳腺,前列腺,结肠,胃,上消化呼吸道,肺,皮肤的恶性肿瘤中都有表达,在此可能同肿瘤发生和组织降解导致的肿瘤细胞侵袭有关。M M P.7 m RN A及蛋白质都是定位于肿瘤细胞,不同于其它大多数M M Ps,它们都是产生于间质[31。基质金属蛋白酶家族及M M P.7简介基质金属蛋白酶( m atri xrnetal l oprotei nases,M M P s) 是一组锌离子依赖性蛋白酶家族,成员很多,目前已发现26种』=M M Ps,可分为可溶性M M P及膜型M M P两大类【4】。可溶性M M P口-] -进一步分为胶原酶,基质降解酶,白明胶酶,基质溶解因子和和其它具有底物特异性的酶。大多数可溶性M M P是以具有前蛋白区的非活化的酶原形式从细胞分泌的[ 41。M M Ps在正常和病理过程中的组织降解和重塑都有重要的作用。这些酶同其它蛋白酶的主要区别是其活化依赖金属离子和中性的ph值[ ” 。酶原形式的M M Ps 牟尹祥挺土学厚革《乒础爿士擎缸蚤j 亡被分泌入基质。在此处被活化可导致组织结构的断裂。各种M M Ps之间的氨基酸序列具有下列基本结构。①信号肽与前肽区,它们都有--80个氨基酸前肽的片段,其中含有与酶激活有关的高度保守序Yl J PRCG VPDV有些含有一个pre段,具有信号肽作用,该区主要是保持酶的稳定性。②催化区,此区有两个zn2+离子结合区和至少一个CF离子结合区。一个为催化性zn2+离子,位于活性中心内,涉及M M P的催化过程,另一个为结构陛zn2+离子。③跨膜区,此区存在于M T-M M P中,有将M T-M M P固定于细胞膜上的作用。④铰链区与类血红素结合蛋白区,铰链区位于催化区与类血红素结合蛋白区之间,以一个二硫键与类血红素结合中蛋白区末端氨基酸残基相连。此区的作用认为与大多数M M P物特异性有关,同时在M M P与组织金属蛋白酶抑制物结合有重要作用。然而,M M P一7只具有前两个区域,而缺乏C末端的血红素结合蛋白同源区域【31【41[51。虽然某些其它的M M Ps。如基质降解...

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