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    靶向抑制Sp1对肝癌细胞Sp1下游基因和细胞增殖的车名影响

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    内容提示: 同济大学医学院硕士学位论文靶向抑制Sp1对肝癌细胞Sp1下游基因和细胞增殖的影响姓名:杨丽娟申请学位级别:硕士专业:肿瘤学指导教师:王理伟;高勇20090501 摘要摘要目的研究M i thram yci nA( 光辉霉素) 对人肝癌细胞H uh一7的促凋亡作用。通过构建质粒表达载体,运用RN Ai 技术,为探索阻断核转录因子Spl 信号通路的新途径及其下游信号通路研究奠定基础。.方法采用CCK一8活细胞计数试剂盒观察M i thram yci n A对H uh.7细胞的生长抑制作用。通过倒置显微镜观察M i thram yci n A作用后细胞形态变化,H oechst33342/PI双荧光染色分析细胞凋亡,流式细胞仪检测肿瘤细胞...

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    同济大学医学院硕士学位论文靶向抑制Sp1对肝癌细胞Sp1下游基因和细胞增殖的影响姓名:杨丽娟申请学位级别:硕士专业:肿瘤学指导教师:王理伟;高勇20090501 摘要摘要目的研究M i thram yci nA( 光辉霉素) 对人肝癌细胞H uh一7的促凋亡作用。通过构建质粒表达载体,运用RN Ai 技术,为探索阻断核转录因子Spl 信号通路的新途径及其下游信号通路研究奠定基础。.方法采用CCK一8活细胞计数试剂盒观察M i thram yci n A对H uh.7细胞的生长抑制作用。通过倒置显微镜观察M i thram yci n A作用后细胞形态变化,H oechst33342/PI双荧光染色分析细胞凋亡,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率。运用Realti m e.PCR法和W estem .bl ot法检测M i thram yci n A不向浓度及不同时间作用后H ul l .7细胞中Spl 、VEG F、c.M et、EG FR表达情况。将Spl shRN A( 短发夹状RN A,shorthai rpi n RN A) 序列克隆到质粒pG Csi 3.0载体,采用H i l yM ax脂质体介导的转染方法将构建的Spl shRN A表达质粒转入H uh.7细胞。采用实时定量PCR技术和W estem .bl ot技术分别检测H ul l .7细胞中Spl 、VEGF、c.M et和EGFRm RN A和蛋白表达水平的变化。结果M i thram yci nA可抑制H uh.7细胞的生长,其机制与诱导细胞凋亡有关。这种抑制作用呈浓度及时问依赖性,半数抑制浓度( IC50) 为60.12nm ol /L。浓度为5× 10"2l xm ol /L的M i thram yci nA作用细胞72h后可明显诱导细胞凋亡,流式细胞仪检测肿瘤细胞出现典型亚二倍体凋亡小峰。M i thram yci nA对Spl 、VEG F、c—M et、EGFR在蛋白水平的表达有抑制作用。Spl制H uh.7细胞Spl 、VEG F、c.M et和EG FRm RN A和蛋白质表达水平。结论shRN A表达质粒能有效地抑M i thram yci n A对H uh.7细胞有明显的生长抑制和诱导凋亡作用。M i thram yci nA能抑制人肝癌H uh.7细胞Spl 及其下游基因表达。si RN ASpl 可下调Spl 表达,Spl 表达水平和VEG F、c.M et和EG FR表达水平呈正相关。关键词:肝癌,细胞,光辉霉素,RN A干扰,凋亡 ABSTRACTABSTRACTO bj ecti veTostudythe effecti onofM i thram yci n A( M IT) onthe hum an l i ver cancer cel ll i ne H uh一7.Toi nvesti gatethesi gnaltransducti onsystemofSpl and i ts dow nstreamgenes by establ i shsi Spl /pG Csi 3.0G FPpl asm i d.M ethodsnegrow thW aSanal yzed byCCK- 8aSsayandthe cel l s w ere observed w i th ani nvert m i croscopei nshape and谢t11 fl uorescencem i croscopei napotosi s dyed byH oechst33342/PI.The effectanal yzed byf l owcytom etry.Them RN Aexpressi onofSp l 姐di ts dow nstreamtargetof M IT on theapotosi srate of tum ourcel l s W aSgenes VEG F,C-M et and EG FR of H uh- 7 cel l s treated w i th di fferent concentrati onsand ti m e of M IT w ere detectedby real ti m e fl uorescencequanti tati vePCR.Thei ts dow nstreamtargetprotei n expressi ons ofSplandgenesw ere detected byW estern—bl ot.Shorthai rpi n RN A( ShRN A) ’W aS desi ghedtoi nhi bi tSplgeneexpressi onandSpl shRN A recom bi nant W aS cl oned i ntopG C—si 3.0 pl asm i d,andtheproductW aS transfected i nto H uh.7 cel l s w i thH i , M ax.The expressi onl evel ofSpland i ts dow nstreamtarget genes VEG F、e- M et and EG FRrnRN A W aS detectedbyti m e—PCR and theexpressi onl evel ofSpl and i ts dow nstreamtarget genesVEGF,C—M et and EG FRprotei nW aS m easuredbyW estem Bl ot.’RealResul tsTreatm ent of H uh一7 cel l s w i th M IT i nhi bi ted cel lgrow thi n adose- dependentandti m e—dependentm anner.The m echani smof thi sphenom enon m aybe associ atedw i thapoptosi s.The ICsoval ue of M n’ for H uh一7 cel l s W aS 60.12nm ol /L.Apoptosi sof H uh- 7 cel l s w as i nducedbyM IT at concentrati on of 5x10-2}tm ol /Lat 72 hours.After 72 hours treated w i nl M IT,som e apoptoti ccel l s w ere detected and atypi calsubdi pl oi d peakW as observedbyfl owcytom etry.Treatm ent w i th M ITsuppressedtheexpressi onofprotei nofSpl and i ts dow nstreamtarget genes VEG F,EG FRandc-M et.nl e SPl shRN Apl asm i d expressi onvector w e m ade coul d knock dow n them RN A andprotei n expressi onofSpl and i ts dow nstreamtarget genes VEGF,c—M et11 ABSTRACTand EG FRofH uh- 7 cel l seffecti vel y.Concl usi onM i thram yci nAcoul deffi ci em l yi nduceapopti si sof H uh一7 cel l s and i nhi bi t thecel l grow th.Treatm entw i thm i thram yci n A( M IT) suppressedtheexpressi onofSpland i ts dow nstreamtarget genesi n hum an l i ver cancer cel lCan knock dow n the Splexpressi on.The expressi on l evel of Splassoci ated w i ththeexpressi onl evel ofVEGF,C—M etandEG FR of H U h-7 cel l s.l i ne H uh-7.Thetechni queof RN Aiw asKey W ords:Huh一7' cel l s,M i thram yci nA,RN Ai nterference,apoptosi sIl l 中英文缩略词表中英文缩略词表( Abrrevi ati ons)A( absorbfl nce)A260( absorbanceat 260nm )bp( base pai r)CCK一8( Cel lcountki t一8)DAB( di am i nobezi di ne)DEPC( di ethyl purocarbonate)D M SO ( di m athyl sul foxi de)dN TP( deoxy- ri bonucl eosi de tri phosphate)dsRN A( doubl e- strand RN A)EB( ethi di umbrom i de)ECL( enhanced chem i l um i nescence)ED TA( di sodi umethyl enedi am i netetra-acetate)EG FR( epi derm al grow thfactorreceptor)ERK( extracel l ul arsi gnal · regul ated protei nki nase)FACS( fl uorescei n.acti vated cel l sorter)FBS( fatal bovi neserum )FQ -PCR( Fl uorescence quanti tati onreal ti m e RT- PCRG 4 18(geneti ci n)G FP( greenfl uorescenceprotei n)ICso( 50%Inhi bi tory concentrati on)LB( 1uri a-bertani )PAG E( pol yacyl am i de gel el ectropH oresi s)V光吸收值260nm 处吸光值碱基对细胞计数试剂盒二氨基联苯胺二乙基焦碳酸盐二甲基亚砜三磷酸脱氧核( 糖核) 营双链RN A溴化乙锭增强化学发光乙二胺四乙酸表皮生长因子受体细胞外信号调节蛋白激酶流式细胞术胎牛血清)荧光定量实时RT-PCR氨基糖苷抗生素绿色荧光蛋白半数抑制浓度LB培养基聚丙烯酰胺凝胶电泳 中英文缩略词表PBS( phosphatebuffered sol uti on)PCR( pol ym erasechai nreacti onPI( Propi di umIodi de)PTG S( post-transcri pti onal gene si l enci ng)RdRP( RN AdependentRN Apol ym erase)Real ti m e PCR( Real ti m epol ym erasechai nreacti on)刚FAi ( RN Ai nterference)RN ase( ri bonucl ease)RT- PCR( reversetranscri pt-.pol ym erasechai nreacti on)SD S( sodi umdodecylsul fate)shRN A( short hai rpi nRN A)si RN A( sm al lj i nterference RN A)Taq( therm osaquati cusD N Apol ym erase)TBS( Trj S bu毹r sal i ne)TBE( tri s..bori c aci d..EDTA)Tri s{tri s(hydroxym ethyl )am i nom ethane}磷酸盐缓冲溶液聚合酶链式反应碘化丙啶转录后基因沉默RN A依赖的RN A聚合酶实时RT-PCRl 矾A干扰RN A酶逆转录聚合酶链反应十二烷基硫酸钠短发夹RN A小干扰IⅢA耐热D N A聚合酶缓冲盐溶液三羟甲基胺基甲烷.硼酸.四乙酸缓冲液三羟甲基氨基甲烷VI 同济大学学位论文原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师指导下,进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名: 物励妨指导刻谧轹1矽甲年歹月22日 学位论文版权使用授权书本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定,同意如下各项内容:按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本;学校有权保存学位论文的印刷本和电子版,并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文;学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务;学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版;在不以赢利为目的的前提下,学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。学位论文作者签名:卡匀锄叻指导教师签名:矽甲"肌汨 引言第1章引言原发性肝癌( H epati cCel l Carci nom a,H CC) 是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。根据W H O 统计,近年来全球每年原发性肝癌的发病率位居所有恶性肿瘤的第5位,由其所致死亡率居第3位,每年有60多万人死于原发性肝癌【IJ 。原发性肝癌更是中国最常见的恶性肿瘤之一,年发病率超过37/10万人,位居全球之剖引。传统的化疗药物对肝癌细胞不敏感,且特异性不高,毒副作用严重,单药有效率很少超过25%。晚期肝癌患者常伴有肝炎、肝硬化及肝功能不全等状况,患者肝功能储备差以及多种合并症状的出现,也制约了细胞毒药物的应用。积极寻找选择性高的抗肝癌药物,仍是肝癌防治研究的重要方向。随着肿瘤发病细胞分子水平研究的深入,根据肿瘤发生中涉及的异常分子和基因,设计和研制针对特定分子和基因靶点的药物,选择性杀伤肿瘤细胞,而不影响正常细胞、组织或器官的功能,是提高疗效、减少毒副作用的一种方法。2007年,首个原发性肝细胞癌分子靶向药物索拉非尼( Sorafi ni b) 应用于肝癌的临床治疗中。索拉非尼是一多靶点的受体酪氨酸激酶抑制剂,具有抗血管生成和抗肿瘤细胞增殖的双重作用。1.1Spl 信号传导通路1987年,核转录因子Spl 首次被纯化、克隆和命名【3】。Spl (Speci fi ci ty protei n1) 是序列特异性的D N A结合蛋白,通过Cys2H i s2锌指D N A结合域与G C盒( G G CG G G ) 和G T盒( CACCC) 结合,可调控下游基因启动子中富含G C序列的细胞和病毒基因的转录过程。近来,与Spl 具有相似结构及转录特性的转录因子( Sp2、Sp3、Sp4) 也被相继发现和克隆,由此构成了Sp多基因家族【4_71。在Sp家族中,Spl 蛋白对G C盒有很强的亲和力,被认为是该家族中功能最强的转录激活因子,参与几乎所有的细胞功能,包括细胞增殖、凋亡、分化和新生物的转化[ 41。研究发现,Spl 高表达与胃癌、胰腺癌的恶性程度呈正相关,与患 引言者的生存期呈负相关,Spl 是影响患者预后的独立因素18。眩】。国外学者在肝癌中亦发现存在Spl 的过度表达,并调控多种癌相关基因的表达【13l 。因此,以Spl基因作为分子靶点,可望成为治疗肿瘤的有效策略之一【141。对许多可调控肿瘤细胞生存、生长和血管生成的基因而言,Spl 是一个重要和必需的转录因子。迄今为止,较为明确可受Spl 蛋白调节的基因有血管内皮生长因子(vascul arendothel i algrow th factor, VEGF) 、胰岛素样生长因子结合蛋白I、成纤维细胞生长因子受体I、类上皮生长因子受体及胸腺嘧啶激酶等。此外,Spl 还可调节Bcl 一1、Bax等细胞凋亡相关蛋白的启动子,通过调控细胞凋亡影响肿瘤细胞的生存和转移潜能[4, TJ s, t61。Spl 的异常表达和活化,可通过促进相关肿瘤生长因子和血管生成基因表达等机制,营造适宜肿瘤生长的局部微环境,正向调节肿瘤增殖、转移潜能和血管生成旧。1.2M i thram yci nA作用机制M i thram yci nA( M IT) 也称为光辉霉素,来自于不同的土生链霉菌。在Ca2+特别是M 92+的存在下,M IT能连接在染色体的G C富集区,并且干扰启动子上的G C模序基因的转录,与D N A形成稳定的复合物,抑制D N A依赖性RN A聚合酶,干扰D N A模板作用,从而抑制.D N A依赖性RN A的合成,M IT发挥作用主要是在RN A延长过程,对RN A合成的起始步骤无影响。M IT为非特异性细胞周期药物,对各期增殖细胞均有杀伤作用【l 8】。除此之外,近来的研究显示对M IT敏感的癌细胞可通过肿瘤坏死因子和抑制P53调节的转录反应来介导细胞凋亡。有人将它用于治疗Paget氏病以及如睾丸肿瘤、慢性和急性髓细胞性白血病等疾病。因能阻断甲状旁腺激素对骨钙的代谢作用、抑制破骨细胞吸收骨质,降低血清钙水平,在过去,M IT用于治疗不同部位恶性肿瘤骨转移所致的高钙血症。最近在裸鼠细胞发育和生长中,发现M IT可特异性的抑制肿瘤细胞Spl 及其下游基因的表达,而对正常组织Spl 无影响【19, 20l 。抑制Spl 的活性被认为是2 引言M IT抑癌的主要机制之一。因此,我们进行当前的研究以探明Spl 是否是一种有效的肝癌治疗的靶点,为探索肝癌治疗的新靶点提供可靠的理论依据。1.3 RN A干扰作用原理RN A干扰( RN Ai nterference,RN Ai ) 能够特异、有效地降解m RN A,引起转录后水平的基因沉默。其主要机制是将与内源性m RN A编码区同源的小片段(19.23 bp) d, 分子干扰RN A( sm al l i nterferi ngRN A,si RN A) 、外源性双链RN A导入细胞中,触发RN A诱导沉默复合体( RN A.i nduced si l enci ng com pl ex,RISC)的形成,RISC进一步引发特定基因m RN A的降解,从而导致特定基因表达沉默的一种技术。由于RN Ai 具有基因抑制效果确切,有严格的序列特异性以及级联式放大效应和高穿透性等特点,因而在恶性肿瘤的研究中具有很好的前景【21, 22】。本课题以转录因子Spl 为研究出发点,从M IT的特异性拮抗功能出发,用己知单用M IT及si RN A会特异性抑制肿瘤细胞Spl 和其下游的VEG F、EG FR表达的原理,来说明阻断Spl 的表达和功能是一种富有前景的肝癌治疗手段,最终实现为临床寻找新的有效治疗肝癌的途径和延长患者生存期的目的。3 第2章材科与方法2.1实验材料第2章材料与方法2.1.1实验细胞株肝癌细胞株H uh-7受惠于上海市肿瘤研究所,置于37"C、5%C02培养箱中。培养,细胞呈单层贴壁生长,每2.3天传代一次,按1:3比例传代。实验时选用对数生长期细胞进行实验。2.1.2主要试剂DM EM 培养液:G i bi co公司,美国胎牛血清:G i bi co公司,美国CCK8细胞增殖试剂盒:Doj i ndo公司,日本M i thram yci nA( M I T) 、PhSi gm a公司,美国H oechst33342:l nvi trogen公司,美国限制性内切酶( Bam HI、H i ndIII) 、Taq pol um erase-TaKaRa公司,日本质粒抽提试剂盒:Prom ega公司,美国si RN A表达载体pGCsi 3.0G FP、克隆用大肠杆菌DH l 0 3-上海吉凯基因技术有限公司T4D N A连接酶:N ewEngl andBi ol abs公司,美国H i l yM ax转染试剂:Doj i ndo公司,日本Tri zohInvi trogen公司,美国引物合成:上海生工生物工程技术服务有限公司。DEPC液:AIl l TCSCO 公司,美国AgaroseITM :Am resco公司,美国D N AM arker D2000:天根生化科技( 北京) 有限公司4 第2章材料与方法M .M LV RT RN aseH一(Del eti on M utant) :Prom ega公司,美国RN asi n⑩Ri bonucl easeInhi bi tor:Prom ega公司,美国dN TP:Prom ega公司,美国SYBR@ Prem i x ExTaqTM :TaKaRa公司,日本细胞及组织总蛋白定量及抽提试剂盒:KC-415,康成生物技术服务公司Anti —Spl ( rabbi tpol ycl onal IgG) :U pstate,美国Anti —EG FR( rabbi tpol ycl onal IgG) :U pstate,美国Anti - VEG F( m ousepol ycl onal anti body) :CH EM ICO N ,美国An廿一c-M et( rabbi tpol ycl onal IgG) :U pstate,美国Beta-acti n:上海康成生物工程公司提供H RP标记抗羊、抗鼠、抗兔二抗:上海康成生物工程公司PVD F膜:购自Roche公司KCrU 化学发光试剂盒:KC-420,康成生物技术服务公司2.1.3主要仪器细胞培养箱:Therm o M O D EL 313l ,美国倒置显微镜:O l ym pus IX70,日本荧光显微镜:Lei ca D M RA,德国超净工作台:BAKER SG 603,美国恒温水浴箱:上海跃进医疗器械厂台式高速离心机:飞鸽牌TDL50B,上海安亭科学仪器厂流式细胞仪:FACSCal i bur E2943,Becton Di cki nson公司,美国756型紫外可见分光光度计:SP.2102U V型,上海光谱仪器有限公司Eppendorfcentri fuge 5417R.Eppendorf公司,德国8453 U V-vi si bl eSpectroscopy System :Agi l ent公司,美国Li ghtcycl er@ PCR仪:Roche公司,瑞士酶标仪:Therm o,美国5 第2章材料与方法电泳仪:北京六一仪器厂电泳、转移装置:BIO .RAD,美国恒温磁力搅拌器:上海司东仪器厂85.2型,上海2.2实验方法及步骤2.2.1光辉霉素工作浓度选择取对数生长期的肝癌细胞H uh.7,以2X 104/100l -d孔密度接种于96孔培养板培养,24h贴壁后吸除原培养液,加入不同工作浓度的光辉霉素,取5X 104、5X 10d、5X 10。2、5X10一、5l xm ol /L 5个剂量组,另设空白对照孔、阴性对照组。分别培养48h到终点时间,每孔加入10txl CCK一8,4h后用酶标仪在波长450nm处测定吸光值( O D450) 。计算细胞存活率,并以至少达到50%抑制率( IC50)的光辉霉素浓度作为实验的最佳工作浓度,用于以后的试验。细胞生长抑制率( %) =【l 一( 试验组A值一本底值) /( 空白对照组A值一本底值) 】x100%。2.2.2光辉霉素时间曲线取对数生长期的肝癌细胞H uh.7,以2X104/1009l 孔密度接种于96孔培养板培养,24h贴壁后吸除原培养液,加入5X10。2l xm ol /L的光辉霉素100pl ,每列设加药组3个复孔和阴性对照组3个复孔,在37℃,5%C02培养箱中培养12h、24h、36h、48h、60h,到终点时间,每孔加入109lCCK-8,四小时后用酶标仪在波长450nm 处测定吸光值( O D450) 。计算细胞存活率,绘制细胞光辉霉素作用时间曲线。2.2.3倒置显微镜观察细胞形态取对数生长期的H uh.7肝癌细胞,以5X104/2m l 孔密度接种于6孔培养板培养,实验组加入5X10之gm ol /L的光辉霉素( 培养液配制) 2m l ,继续培养24h、48h、72h,倒置显微镜下观察细胞结构的变化,流式细胞仪测凋亡率。6 第2章材料与方法2.2.4荧光显微镜观察细胞形态收集H uh一7肝癌细胞,PBS液洗涤细胞,弃上清,取509lO .1m g/m l 的H oechst33342加450p1 PBS( 工作浓度为1099/m 1) 37。C孵育15分钟,加PBS液低速离心,吸上清,取509l 0.5m g/m l 碘化丙啶加450“ l PBS液( 工作浓度为509∥ m 1) ,常温染10分钟后洗涤细胞,离心弃上清涂片。在荧光显微镜下观察并拍照。2.2.5流式细胞仪( FCM ) 检测不同浓度光辉霉素作用后细胞凋亡情况取对数生长期的H uh-7肝癌细胞,以5× 104/2m l 孔密度接种于6孔培养板培养,细胞培养过夜,至80%融合贴壁后,加入不同浓度的光辉霉素,设5× 10-3、5× 10~、5× 10‘ 1pm ol /L 3个剂量组,另设阴性对照组。培养48h后收集细胞,PBS洗涤细胞,弃上清,70%酒精固定,4℃冰箱放置2h后,离心去上清,加入终浓度0.33m g/m l 碘化丙锭溶液( PI) 室温避光孵育15m i n,流式细胞仪检测凋亡率。2.2.6流式细胞仪( FCM ) 检测光辉霉素作用不同时间后细胞凋亡情况取对数生长期的H uh-7肝癌细胞,以5× 104/2m l 孔密度接种于6孔培养板培养,细胞培养过夜,24h贴壁后,加入5× 10之gm ol /L的光辉霉素,继续培养24h、48h、96h,到终点时间胰酶消化,收集细胞,PBS洗涤细胞,弃上清,70%酒精固定,4℃冰箱放置2h后,离心去上清,加入终浓度0.33m g/m l 碘化丙锭溶液( PI) 室温避光孵育15m i n后,离心去上清,在反应管中加4001xl PBS,用流式细胞仪检测凋亡率。2.2.7质粒构建2.2.7.1转录因子Spl si RN A寡核苷酸的设计与合成根据G enebank中报道的Spl 核苷酸序列( N M 一138473) ,按照si RN A设计7 第2章材料与方法原则,针对Spl 基因编码区选取19个核苷酸作为si RN A作用靶点,共选择3条靶序列( 见表2.1) ,各设计1条19nt的随机寡核苷酸序列,并排除其非特异同源性。每对寡核苷酸两端分别带有Bam HI和H i ndIII酶切位点。表2.1 si RN h靶序列2.2.7.2质粒si Spl /pGCsi 3.0G FP构建、扩增及抽提用H i nd III和Bam HI限制酶将l “ l 的pG Csi 载体线性化。将2¨ l 退火后的si RN A寡核苷酸片段加到T4 DN A连接酶缓冲液中,接着再加1 Ixl pGCsi 载体、5山DEPC水、1 plT4 DN A连接酶,室温下温育过夜。再转入处于感受态的E.col iD H l 0p,在含有氨苄青霉素的琼脂糖平板上过夜生长,随机挑取单个菌落,放入含氨苄青霉素的LB培养液中扩增培养,次日按说明书操作以试剂盒进行质粒纯化抽提,并命名为si Spl /pGCsi 3.0 G FP。挑单克隆少量抽提质粒,送上海吉凯基因技术有限公司测序。2.2.7.3质粒含量和纯度的测定用重蒸水洗涤比色皿,吸水纸吸干,加入TE缓冲液后,放入样品室的池架上,关上盖板。将标准样品和待测样品适当稀释( DN A59l 或RN A41xl 用TE缓冲液稀释至1000}t1) 后,记录编号和稀释度。然后计算待测样品的浓度与纯度。D N A样品的浓度( p∥ p1) =O D 260× 稀释倍数X 50/1000。质粒的纯度根据O D 260/O D 280比值判定:介于1.6.1.9之间纯度较好,纯D N A:O D260/O D280≈1.8。>1.9,表明有RN A污染;<1.6,表明有蛋白质、酚等污染。8 第2章材料与方法2.2.8细胞培养和质粒转染将细胞置于DM EM 高糖培养液( 含10%胎牛血清、100}|, g/m l 青霉素及1001ag, ' m l 链霉素) ,37"C,5%C02培养箱中培养。转染前l 天将处于对数生长期的细胞以10000个/孔( 细胞密度约为50%) 接种于24孔板,按照Splsi RN A质粒0.51xg、1.0l xg、1.51-Lg,Hi l yM ax l 山、21xl 、3pl 的不同比例转染细胞,并以pG Csi 3.0G FP空载体作为对照组。转染后4小时更换含10%胎牛血清、无抗生素的DM EM 高糖培养液。于转染后72h之内在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。2.2.9实时定量PCR法检测不同浓度、不同作用时间光辉霉素作用后及si Spl /pG CsD .0 G FP转染huh-7细胞后Spl 、VEG F、EG FR、c—M etm RN A表达情况本试验选用的是标准曲线的相对定量法。标准曲线法的相对定量:由于在此方法中量的表达是相对于某个参照物的量而言的,因此相对定量的标准曲线就比较容易制备,对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的靶序列的量来自于标准曲线,最终必须除以参照物的量,即参照物是1倍的样本,其它的样本为参照物量的n倍。在实验中为了标准化加入反应体系的RN A或DN A的量,往往在反应中同时扩增一内源控制物,如在基因表达研究中,内源控制物常为一些管家基因( 如beta-acti n,3.磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH等)。2.2.9.1试验分组分为空载体组、转染24h组、转染48h组。2⋯2 92细胞总RN A提取待细胞培养瓶中的H uh.7细胞生长稳定,贴壁生长至70%一80%融合时,吸去上清,以每l O cm 2面积的细胞加入l m l Tri ozol 的比例,向培养瓶内直接加入Tri ozol 试剂溶解细胞,吹打细胞溶解物数次,将混和物移至1.5m l Eppendorf管,9 第2章材料与方法将细胞溶解液在室温孵育5分钟。后放置于一80℃冰箱保存。溶解于Tri zol 中的样本在冰上放置至融化。加入约1/5体积的氯仿,上下颠倒充分混匀l m i n左右,室温下静置15m i n。4"C、12000rpm 离心15m i n,离心后液体分为三层,底层是苯酚一氯仿相,交界处为白色云状物,上层无色水相中含有RN A。小心取出上层液并转入一个无RN A酶的EP管中,加入等体积的异丙醇,轻轻颠倒混匀,室温静置15m i n。4"C、12000rpm 离心10m i n,去上清,可以看到细小的白色物质即为所制备的RN A,向沉淀中加入l m l 75%DEPC乙醇,4"C,12000rpm 离心洗涤沉淀15m i n,弃上清。沉淀室温干燥5分钟,加入501xl 无RN Aase的0.I%DEPC水溶液水充分溶解沉淀。2.2.9.3引物设计利用软件Pri m er Prem i er 5.0设计特异性引物,序列如下:表2.2基因名称( N CBI G enbanknum ber) 及引物序列( 5' t0392⋯2 94逆转录合成cD N A在体积为25111的逆转录管中加入2 l xg总RN A,l l xl20I.tm ol /L O l i go( dT) 15引物,补DEPCH 20至15 pl 。70℃加热5m i n,冰上放置2m i n,随后在管中补充下述成份:5山的5× M .M LV反应缓冲液、200U 的M .M LV逆转录酶H 、1.251al10 第2章材料与方法10m m ol /L dN TP、25URN A酶抑制剂、补DEPC水至251xl ,轻轻混匀上述反应液,放置于42℃反应60m i n后,合成好的eDN A置一20℃备用。2.2.9.5实时定量PCR扩增步骤标准品进行10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍稀释。稀释后的样本和标准品配置含如下试剂的PCR反应体系:5山2× SYBRPrem i x ExTaq,2肛l lrtm ol /L上游引物,2 p11}tm ol /L下游引物,ll al cDN A样本,补ddH 20至10“ l 。反应条件是预变性95℃1分钟,变性95"( 25秒,退火60℃5秒和延伸72*( 230秒,共40个循环。最后72℃延伸30秒,37℃30秒。表2.3Li ghtCycl er荧光检测PCR仪的设定程序仪器荧光检测通道选择SYBRG REEN ,其它为默认值。反应完毕后,进行数据的收集和统计学分析。2⋯2 96数据处理反应完毕后,进行数据的收集和统计学分析:( 1) 绘制样本的管家基因和目的基因的标准曲线:将该eDN A样本原液浓度定为l ,标准品的浓度C则由1除以稀释倍数得来,分别为0.1、0.02、0.01、0.002、0.001,浓度C取对数值得到LgC。( 2) 荧光域值( Threshol d) 的设定:扩增结束后,先进入扩增动力学曲线界面( Am pl i fi cati on) ,双击曲线纵坐标,选择线性.线性曲线坐标方式,软件分析系统便自动绘制出以循环数( Copi es) 为横坐标,以荧光强度变量( Del taRn) 为纵坐标的动力学反应曲线,移动荧光域值线,使其尽量在所有扩增曲线的拐点处( 或者选择荧光域值的缺省设置,即以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,以6.15个循环的荧光信号的的标准差的10倍为荧光域值,每个扩增管内的荧光信号达到设定的荧光域值所 第2章材料与方法经历的循环数,就是循环域值Ct。( 3) 得到各扩增管循坏域值( Ct) :待完成荧光域值的设定及标准曲线的建立后,进入报告界面( Report) ,分析软件便可得到各扩增管的Ct值。( 4) 数据分析:将该标准品的LgC值为横坐标( x) 和CT值为纵坐标( Y) 输入Excel表,通过数值分析自动绘制出相应的以其拷贝数的对数( 19C) 为横坐标、以循环域值( Ct) 为纵坐标的标准曲线,并可显示标准曲线的公式( Y_斜率X+截距) 等相关参数,如回归系数r、截距、斜率Sl ope等。( 5) 相对原始浓度C的获得:将各样本G APD H 管家基因和目的基因的CT值( Y) 代入标准曲线公式,得到横坐标( X) LgC值,通过反对数得到C值。此C值是样本稀释n倍后的浓度,所以eDN A样品的原始浓度要x稀释倍数n。例如本实验的样本稀释50倍,所以原始浓度=浓度C× 50。( 6) 平均值和标准方差SD的获得:样本基因的原始浓度C值除以管家基因G APDH 的原始浓度C值得到相对原始浓度的比值,因每个样本重复3次。通过该相对原始浓度的比值,求得平均值和SD值,绘制柱形图得到各样本基因表达的趋势。2.2.10W estern.bl ot法检测光辉霉素作用及si Spl /pGCsi 3.0G FP转染H uh.7.细胞后Spl 、VEG F、EG FR、c-M et表达情况2.2.10.1细胞准备将细胞接种于75cm 2培养瓶中,共种16瓶。其中12瓶细胞培养24小时细胞贴壁后吸弃培养液,取2瓶细胞加入l O m l 培养液而未加药,取2瓶细胞加入0.005pm ol /L M i thram yci nA lO m l ,取6瓶细胞加入0.051xm ol /L M i thram yci nA10m l ,取2瓶细胞加入O .1l xm ol /L M i thram yci nA10m l ,取2瓶细胞加入0.5pm ol /LM i thram yci nA10m l ,培养24小时后每个浓度各取2瓶细胞,共10瓶细胞。培养36小时后,取0.051xm ol /L浓度2的瓶细胞。培养48小时后,取0.051am ol /L浓度的2瓶细胞。所有细胞均置于15m l 离心管中1000r,7m i n离心,弃去上清液,用PBS液洗涤2次,后置于.80℃冰箱保存。另4瓶细胞( 细胞密度约为50%)12 第2章材料与方法按照脂质体转染试剂盒H i l yM ax( Doj i ndo公司,日本) 说明书进行操作。2.2.10.2蛋白提取配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂( 1m l 抽提试剂中加入5pl 蛋白酶抑制剂混合液,5pl PM SF和5pl 磷酸酶混合液) 。在上一步骤的离心管中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂( 107个细胞中加入l m l 抽提试剂) ,轻轻摇动5分钟。转移细胞悬浮液到离心管中,冰浴下摇动15分钟进行裂解。裂解液于预冷的离心机中12,000 g离心15分钟。弃去沉淀,上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。2.2.10.3 BCA蛋白定量方法配置BCA工作液( W R) 方法如下:每孔需配置200 pl 的BCA工作液。以50份BCA试剂A加1份BCA试剂B( 50- 1,试剂A:试剂B) 的比例混合以配置BCA工作液( W R) 。如10个孔的实验需要用2 m 1试剂A混合40pl 试剂B。试验步骤如下( 样品和W R比例=1:8) :分别吸25pl 标准品到微孔板的对应孔中(浓度为0.1000pg/m 1)。分别吸取2.51al 待测样品至微孔板对应孔中,并加入22.5肛l 稀释液。每孔加入200pl 的W R,震板30秒以彻底混合均匀。盖好微孔板,370C孵育30分钟,冷却至室温。测量562nm 附近( 540.590nm 皆可以使用) 的各孔吸收值。测得的每个标准孔和待测样品孔的吸收值分别减去空白孔平均光吸收值,以校正过的BSA标准蛋白562 ni /l 测量值对其浓度( pg/m 1) 做图绘制标准曲线。使用标准曲线定量待测样品蛋白浓度。2.2.10.4 SD S.PAG E电泳按6 pl 蛋白样品加入3 pl3 X上样染液处理待检蛋白样品。每孔配制含50嵋总蛋白样的样品液,煮沸3分钟。将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样,标准加进第一个孔中。使用Bi oRad电泳装置,80V恒定电压下电泳至染料接近分离胶顶端。然后120V恒定电压电泳至溴酚蓝刚出胶底部,中止电泳。将电泳完毕的SDS.聚丙烯酰胺凝胶从电泳槽取下后,对照M ark,200m A恒流条件下,40C转PVD F膜2h。取膜,加阻断液10m l ,室温震荡30m i n。倾尽阻断液,换加含适当稀释度第一抗体,40C震荡12h,TBST 第2章材料与方法洗膜3次,每次5分钟。加入H RP标记的二级抗体以结合一级抗体及H RP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准,室温孵育膜l 小时。TBST洗膜3次,每次5分钟。将KCTM 化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液。将膜置于反应液中室温孵育3分钟。去除过量的溶液,将膜夹在两塑料薄膜之间,以X光胶片曝光。图片扫描保存为电脑文件,并用Im ageJ 分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。2.3统计学分析应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析,实验数据用均数± 标准差( 孑± SD)表示,组间差异采用单因素方差分析,组间比较采用Student-N ew m an.Keul s法,尸<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异有显著的统计学意义。14 筇3章结粜第3章结果3.1M i thram yci nA对H uh一7细胞的生长抑制作用M i thram yci nA浓度为5× 1矿和5× 10-3¨ .m ol /L时,细胞生长受到轻度抑制。药物浓度增加到5× 101和5I.tm ol /L时,对细胞生比肯较明显的抑制效应,不同浓度组问的生长抑制率与对照组比较差异有统计学意义( P<0 O l ,衰3 1) 。其量效曲线见图31。M i thram yci n-A随时间延长抑制率逐渐增高,作用24小时时抑制率为615%,作用60h最大抑制率达72 65%( 表3 2) ,其浓度时间曲线见圈3.2。结果显示,M i thram yci n A对H uh.7细胞的生长抑制作用呈剂量和时间依赖关系。Icso为60.12m nol /L。薹:舡暮表31不同浓度的M i thram yci nA对H u卜7细胞的生长抑制作川注:宴验组与对J {( i 组比较,F-4804 789,P=O 000冲制牛2 5M trr对毁浓度(札.IM )2窖15810 5图3I 48小时M i thram yci nA量效曲线幽3.2M i l hram yci nA取IC50浓度时时间曲线15蛐舯舯柏椰∞o∞ 第3章结果表3.25× 104¨ m ol /LM i thram yci nA不同时间时对H uh7细胞的1 K抑制ff=用注}实验封1与对j ! Ic组比较,F=158 15l ,P=O 0003.2倒置显微镜观察对照组及实验组细胞结构变化对照组H uh-7细胞为贴壁生长,细胞生长速度快,形态不胤整,呈三角形、单形和多边形,核居中,大而尉。药物组细胞数量较对照组减少,随药物作用时间的延长,越来越多的细胞山多边形变成圆形.施核浓缩,体积变小,折光度下降,部分细胞脱壁呈半悬浮状态,随后细胞皱缩,裂解似爆炸开的“ 菜花”状( 图3 3)。削3.3倒置显微镜下细胞形态的变化fx2001A:对照组;B、c、D:实验组( M i thram yci n A5× 102¨ m ol /I浓度作用24h16 第3章结果3.3荧光显微镜观察对照组细胞大小致,被透过活细胞膜的H oechst33342染成监色,荧光均匀.少见细胞膜破裂从而被PI染成橘红色的坏死细胞。实验组细胞H oechst33342,PI染色也呈蓝色,细胞体积缩小,胞质浓缩,胞核固缩,核碎裂,细胞呈亮珠状蓝色荧光和形成凋亡小体等典型的凋亡细胞形惫改变,晚期凋亡细胞染色呈橘红色,但仍町见舆型细胞核染色质凝集改变( 图3 41。A:对照组:B、C、D:实验组( M i thram ycl nA 5x10‘ 2l l m ol /L浓度作崩24h、48h、72h后)幽3.4荧光显微镜r观察细胞H oechst/Pl 染色情况3.4流式细胞仪检测细胞凋亡率不同浓度时测得捌亡牢见嵌3.3。不同浓度的M i tta' am yci nA作用48h,在浓度为5× 10‘ 3J _tm ol /L时未见凋亡峰,当浓度为5× 104pm ol /L时出现凋亡峰,当浓度为5× 10。1}tm ol /L时拥I、:峰最明显。随药物浓度的增加,凋l :‘ 率渐增加,表现 第3幸结果为量效依赖性( 图3 5) 。不同时间时测得凋亡率见表3.4。50nm ol /L浓度M i thram yei n A处理H uh-7细胞后24h,流式细胞仪未检测出凋亡峰,与对照组比较,处于各个周期的细胞百分率无明显改变。继续作用到48h,出现典型亚二倍体凋亡小峰( 图3 6) ,这提示M i thram yci nA诱导凋亡作用具有时问依赖性。表3.348小时时不同浓度M i thram yci nA对H uh-' /细胞凋亡的影响( i 4-s.n=3)组别对照组0药物浓度( ptm ol /L) 凋亡率r%10 73± 0 735× 1010± 0实验组5× 10。28 24--+0 56· t5× 109 79± 0 61· ·与对照组比较+P<0 05,- t P<0 01,且两两比较,除对麒组和5× 101pm ol /L浓度组外其余P<0 01。A:对照组:B、c、D · 实验组( M i thram ycl nA5× l ff3、5× 10‘ ’ 、5× 10。‘ l Lm ol /L的浓度作用48h)图3 5流式细胞仪检测小剧药物浓度时48h细胞凋亡率 第3章结果表3.45× 】02um ol /LM i thram yci nA不同时间捅亡率( 章i S.n=3)时间组别凋亡率(%)24h对照组实验组对照组0 28± 0 482 60± 0 4248h0 73± 0 73实验组对照组04- 08 244- 0 5672h实验纽29 4】± 1 85+‘与对j ! c【组比较· P<005,· · P<0 O l ,且三个实验纽之间两两比较,P<0 0A1、B1、C1:( 24h、48h、72h对照组subG l ) ;A2、B2、C2:( 5× 10。2¨ m ol /LM i l hram yci nA作用24h、48h、72h的实骑组subG l )图3.6流式细胞仪检测相同浓度不同作用时间时细胞凋亡率19止一。厶k~,q目;翊q.H。H]寸q1爿翻j,qi鼍jq—引qIql+ 第3章结果3.5si Spl /pG Csi 3.0 G FP基因测序结果由于核苷酸片断分别带有BaraHI、H i nd 111酶剀位点,经过酶切鉴定,我们得到了3种寡聚核苷酸的I;甘性重组质粒,井经测序鉴定证明插入寡聚核苷酸完全『F确,没有碱摹突变,与原合成序列一致测序结果见图3 7。载体构建示意图见图3 8。幽3 73种si Spl /pGCsi 3 0G FP寡聚棱苷酸基|_l ! I测序列i1≈㈣tm cT㈣⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Ⅲc,n一”呈· 二罢oo}oL__罢三一,⋯n㈣⋯c⋯㈣一一w图3.8载体构建示意崮㈣■ ㈣2t,㈣⋯⋯CAGATTAc⋯⋯⋯~㈣GT⋯一⋯3.6Spl si RN A转染H uh一7细胞的效率( 1) 对于H uh一7细胞,当si RN A与H i l yM ax转染试剂的比例为1:4—1:6之间时且在转染后48h时效率最佳,见罔3.9,图3 10。 第3章结果幽3 12 si RN A24h量日 第3章结果G■ “ EH 吣∞¨1制EH吣1吣∞xP-㈣FLI.H*P【Lo口lh■ ^*LL4t.晰E州‘ 《钿‘ 卅《1h■Al l 1*㈩0∞∞*∞M 119.3fh52aD%∞肪20%幽3I 3 si RN A48h组3.7对M IT及si RN A作用于H uh一7细胞对Spl 、VEGF、EGFR、c.M etm RN A表达量的影响将梯度稀释的DN A模板以及所有cDN A样品分别配置实时定量PCR反应体系后丁Li ghtcycl er。荧光定量PCR仪上得到每循环的定量荧光数据( 圈3 14),并根据此数掘绘制标准曲线( 图3 15、。≮j∥ ≮。‘5。” ^5嚣■ 一~”疹。∥弘∥ 7|_;:;.:髫C=一~~’ 一D固Sg-娼&}。 第3章结果Ⅱ罔3 14实时定量PcR反应各循环荧光定晕数据图(A:GAPDH .B:Spl Spl ,C;EGFR.D:VEGF, E:c-M et吲3 15宴时定量PCR反应标准曲线( A:GAPDH ,B:Spl Spl ,C;EGFR, D:VEGEE:c-M et) 第3章结果3.7.1不同浓度M i thram yci nA作用H uh.7细胞后其Spl 、VEG F、EG FR、c-M et m RN A表达量的变化结果显示( 如图3.16) ,与未加药对照组Spl m RN A表达量( 1.4599± 0.2696)相比,Spl 的m RN A表达量与浓度有关,500nM 时其表达量( O .2743± 0.1043)下降约81.21%( P<0.01) 。VEG F、c.M et和EG FR的m RN A表达量变化有一个相同的趋势,即随浓度增加其m RN A水平逐渐下降。A:对照组B、C、D :M IT组( 5X 10。、5X 10~、5X10。1pm ol /L)图3.16实时定量PCR检测不同浓度M IT对Spl 、VEG F、c-M et、EG FR表达的影响与对照组相比,AP<0.05,· P<0,01 第3苹结果3.7.2 M i thram yci nA作用H uh.7细胞不同时间后其Spl 、VEG F、EG FR、c-M et m RN A表达量的变化与未加药的对照组相比,Spl 在72h时表达量明显下降( P<O .01,图3.17) 。VEG F m RN A表达量也随时间增加逐渐下降。e-M et m RN A及EG FRm RN A表达量也随时间增加逐渐下降。A:对照组B、C、D :M IT组( 24h,48h,72h)图3.17实时定量PCR揪lJ 5× 10。2l m aot/L M IT作用不同时间后对Spl 、VEGF、c-M et、EG FR表达的影响与对照组相比,AP<O .05,· P<0.013.7.3 si RN A作用H uh.7细胞后其SPl 、VEG F、EG FR、c-M etm RN A表达量的变化结果显示(如图3.18),si Spl /pGCsi 3.0G FP转染H ul l 一7细胞后,与空载体组Spl rnRN A表达量( 1.9564士0.3843) 相比,在转染后24h,Spl 的m RN A表达量(O .5525士0.0551)下降约71.76%,48h时表达量(O .7098士0.1387)下降约63.72% 第3章结果( 尸<0.01) 。VEG F m RN A表达量在转染24h时与空载体组间无显著差异,转染后48h其表达量下降才有统计学意义。e-M et的m RN A表达量在转染后24h和48h明显下降( 尸<0.01) 。而EG FR的m RN A表达量有个先升高再降低趋势,但单因素方差分析结果,P=o.035。图3.18 si RN A作用H uh.7细胞后m RN A实时定量PCR分析结果与对照组相比,/xP<0.05,· P<0.013.8M IT及si RN A作用于H uh.7细胞对Spl 、VEG F、EG FR、c-M et蛋白的表达的影响在含有不同浓度M IT的培养皿中孵育H uh.7细胞24h,取蛋白以供W estern印迹分析Spl ) 及t其下游分子的表达。如图3.19所示,M IT对spl 和其他蛋白产生了浓 第3章结果度依赖性的抑制。我们的研究展示了M IT抑制了spl 及其下游分了,包括VEGF、EO FR的表达。这些数据说明M IT对H uh-7细胞s口l 及其下游分子的表达有作用。sp】m _一m 一一vEGF~一一EGFR” _-_M · 1一但是对c.M et来说基本没有多大影响,如图3 20所示。ABCDEABCDEIm~“ ∞&“ n∞m _- ● _-A:止常对照组B、C、D、E:实验组( 5× 104、5× 10 2、101、5× 10。i tm ol /L的M i thram yci nA作用24h)圈319we蝴蛳检测不同浓达的M I影T响spl、VEGF,EGFR,。’ M “ 袁1^ul葛¨lnsO ^¨0|『IIi洲i『i|对耻5xl 叶H瑚“ m 2州1—1州pM M ¨ 坤M图3 20不同浓度M IT作用后蛋白相对音量与对照纽相比。△ P<0 05.· P<0 0取5× 10‘ 2岬ol 几的M i 曲锄yci nA作用24h、48h和72h后的细胞,取蛋白咀供w esIem 印迹分析spl 及其下游分子的表达。如图3.21所示,M IT对spl 和其他蛋白产生了时间依赖性的抑制。我们的研究, 鼹示TM IT抑制fSpl , 醍其下游分子,包 第3章结果括VEG F、EG FR、c.M et的表达。这些数据说明M IT对H uh一7细胞Spl 及其下游分子的表达有作用。Splm .一一vEOF一¨ 一ABCDABCDlm ● _^一¨ 一EG FR m ‰_m _c- M d2009⋯一50DB。日⋯● O m --__1401∞-l _O ⅡPAj 止常对照组B、C、D:实验组( 5Xl O 。“ rnol /L的M i thram yci nA作_LIJ24h.48h,72b)图3.21 W estern.bl ot检测5× 10‘ l Im ol LLM IT作用不同时间后对Spl 、VEGF、EG FR、cfM et表达的影响酗3.22 5XI口2pm ol /LM IT作削不同时间后蛋白相对含量与对照组相比.△ P<O05,· P<O0如图3 23所示,si Spl /pGCsi 30G FP转染huh-7细胞24h后,Spl 、VEG F、EGFR、c—M et蛋白表达的水平均有所下降。提示Spl 蛋白表达水平与VEGF、EGFR、c.M ete:白表达水平有关。si Spl /pGCsi 3.0G FP转染24h后其蛋白相对含量 第3章结果见图3 24ABspl :一一VEGFEGFR=:一~。M t=一一B-act;n:一——AB|璺}323W estern.bl ot检测si Spl /pGCsi 3 0G FP转染huh- 7细胞24h后对spVEG F、EG FR、c-M el 表达的影响A:空载体组B:si RN A T扰24hl ●l jl:¨l ¨¨n】嘲3.24si SpI/pG Csi 30G FP转染24h后蚩白相对含茸b对照组相比,△ P<0 05.· P<00 第4章讨论第4章讨论由于大多数遗传、后天因素和微坏境因素对基因表达的影响是通过控制基因转录,所以人们广泛地研究基因表达的转录调节。虽然许多上游因子可能影响下游反应元件的表达和功能,只有有限的几个转录因子可能把这些因子转导至这些反应元件‘ 231。阻断所有相关信号通路是不实际的。靶向大多数通路的集合点转录因子是可能的,这些转录因子最终能调控涉及细胞生物学各方面的基因的表达。本实验运用M i thram yci nA和si RN A两种方法特异性的靶向Spl 来研究其功能及信号传导通路。M i thram yci nA量效曲线和M i thram yci nA时间曲线说明M i thram yci nA对人肝癌H uh7细胞有抑制增殖作用且有时间和浓度依赖性。通过倒置显微镜观察细胞形态也证实了这一点。为探讨M i thram yci n A细胞毒作用机制,进一步采用H oechst33342/PI双荧光细胞染色,显示药物作用后凋亡细胞染色质裂解凝集呈亮珠状,但细胞膜完整,所以被能透过活细胞膜的H oechst33342染成蓝色,随着时间延长可见细胞膜破裂从而被PI染成橘红色的坏死细胞。因此,认为M i thram yci nA能促进细胞凋亡,且有时间依赖性。用流式细胞仪分析进一步证实了M i thram yci n A对人肝癌H uh.7细胞有促凋亡作用,且有时间和浓度依赖性。分析其原因可能是很多促凋亡和抗凋亡基因的启动子包含Spl 位点。提示Spl和Sp家族的其它成员与凋亡的调节有关[24-32】。本实验发现Spl 的下调导致最大约29.41+1.85%细胞发生凋亡。利用W estem .bl ot技术分析其可能机制,发现不同浓度M IT作用人肝癌H uh7细胞后,Spl 和其下游分子VEG F、EG FR、c—M et均相应表达下降。提示M i thram yci nA对人肝癌H uh7细胞的促凋亡作用是通过抑制Spl ,进而下调下游分子VEG F、EG FR、c.M et而引起的。然而M IT作用人肝癌H uh7细胞后,Spl 和其下游分子VEG F、EG FR、c.M etm RN A水平并没有出现类似效应。考虑是由于基因m RN A水平表达和蛋白水平 第4章讨论的表达影响因素不同。同时,M i thram yci n作用有可能通过多种途径。进一步利用特异性RN A干扰技术将Spl 的表达下调,分析Spl 对下游基因转录调控的作用。发现当运用的小干扰RN A后Spl 和其下游分子VEG F、EG FR、c.M etm RN A水平出现类似表达下调,与蛋白水平的表达下调相关。人们发现H SF/SF受体c.M et在人肌与骨骼恶性肿瘤及其它类型软组织肉瘤中存在过度表达133】。研究表明[ 34-36] ,Spl 调节M ET和H GF...

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